Kutatási terv

 

 „Diagnosztikus, prediktív és prognosztikus biomarkerek azonosítása rosszindulatú daganatos megbetegedésekben” című kutatáshoz

  1. A vizsgálat célja:

Célul tűztük ki a Semmelweis Egyetem (SE) klinikáinak ambulanciáin és fekvőbeteg osztályain kezelt, rosszindulatú daganatos megbetegedésekben szenvedő betegek biológiai mintáinak (tumor,- normál szövet, vér) gyűjtését és tárolását, valamint klinikai adatainak hosszútávú gyűjtését, amellyel a kórlefolyásról és túlélésről kaphatunk információt. Szöveti mintavétel minden esetben csak a daganat eltávolításának céljából történik, a Semmelweis Onkobank ezeket a mintákat formalin-fixált, paraffinba-ágyazott (FFPE) formában vagy krioprezervált preparátumként kapja meg. A vérminták beküldése történhet natív, anti-koagulánst vagy pro-koagulánst tartalmazó vérvételi csövekben is, amelyekből plazma, szérum vagy buffy-coat kerül elkülönítésre. Az Onkobankba érkezett mintákból DNS, RNS és fehérje kerül izolálásra, amelyeket genomikai, transzkriptomikai és proteomikai vizsgálatokhoz használunk fel. Az így kapott adatok elemzése által a daganatképződéssel együttjáró mutációs,- génexpressziós,- és fehérjeexpressziós profilokat állíthatunk fel, amelyekkel diagnosztikus, prediktív és prognosztikus biomarkereket azonosíthatunk be. A biomarkerek, illetve a túlélési adatok ismeretében lehetőségünk nyílik olyan egyéni, “omikai” kombinációk feltárására, amelyek a betegek korai, pontosabb diagnózisát, betegségük lefolyását, illetve a terápiás válaszukat befolyásolhatják.

A Bioinformatika Tanszék végső célja tehát egy olyan újgenerációs onkológiai egység, a Semmelweis Onkobank (Semmelweis Onkológiai Szövetbank), létrehozása és működtetése, amely Európában egyedülállóan dolgoz fel és tárol rosszindulatú daganatos megbetegedésekben szenvedő egyének vér, illetve szövetmintáit és az azokhoz tartozó klinikai-, genomikai, transzkriptomikai- és proteomikai adatokat. A minták tárolása - stabilitásuk, érzékenységük és a tárolási idejük függvényében - történhet szobahőmérsékleten, 4°C-on, -20°C-on, -80°C-on vagy -196°C-on.

 

  1. A vizsgálat elrendezése:

 

A mintegy 25 évre tervezett kutatási időszakot (2021. 05. 01.-től kezdődően) a betegek túlélésének monitorozására használjuk (utánkövetés) a gyűjtött adatok függvényében.  A betegtoborzás korra és nemre való tekintet nélkül megvalósulhat. A kutatásba való bevonás elengedhetetlen feltétele a beteg tájékozott hozzájárulása a vizsgálatokhoz a “Betegtájékoztató” és a “Betegbeleegyező nyilatkozat” aláírásával. A nyilatkozat bármikor, hátrányos következmények nélkül visszavonható a “Betegbeleegyező nyilatkozat visszavonása” c. dokumentum aláírásával. A kritériumrendszerek részletes leírása a “Kutatási engedélykérelem” c. dokumentumban olvasható.

 A fenti feladathoz a megfelelő infrastruktúrát és a személyi feltételeket a Semmelweis Onkobank biztosítja, a betegek biológiai mintáit pedig az intézet megbízott orvosai, szakasszisztensei szolgáltatják részünkre. Munkatársaink, szakembereink szakmájukra hivatásként tekintenek, munkájukat pedig ennek szellemében, a lehető legkörültekintőbben végzik el. Az Semmelweis Onkobank vezetése biztosítja, hogy munkatársai a minőségirányítási rendszeréhez tartozó dokumentumokat megismerjék, munkájuk során alkalmazzák és a fenti tevékenységeket az MSZ EN ISO 9001:2015 szabványoknak megfelelően végezzék el.

A Semmelweis Onkobank résztvevő tagintézményei a várható, éves mintaszámokkal:

        I. Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet

        I. Sz. Sebészeti és Intervenciós Gasztroenterológiai Klinika (n=1000)

        II. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika (n=120)

        II. sz. Patológiai Intézet

        Asklepios Kliniken Hamburg GmbH

        Bioinformatika Tanszék

        Bőr-, Nemikórtani és Bőronkológiai Klinika (n=400-2000)

        Laboratóriumi Medicina Intézet

        Onkológiai Központ (n=100-1920)

        Országos Klinikai Idegtudományi Intézet

        Orvosi Képalkotó Klinika

        Pulmonológiai Klinika (n=500)

        Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika (n=600)

        Urológiai Klinika (n=200-600)

 A Semmelweis Onkobank megvalósításában közreműködő munkatársak:

        a Semmelweis Onkobank tudományos irányítója,

        a Semmelweis Onkobank koordinátora,

        a mintavételt végző orvosok,

        a diagnosztikai véleményt alkotó patológusok,

        a szövettani feldolgozást végző asszisztensek,

        a vérvételben és adatrögzítésben szerepet játszó nővérek és asszisztensek,

        a laboratóriumi orvos,

        a laboratóriumi munkatársak (mintagyűjtés, - feldolgozás…),

        a Semmelweis Onkobank adatbázisának felelőse

  

3.    A vizsgálat módszertana, megszervezése:

 

3.1. Tájékoztatás

 Vizsgálataink alapvetően két színtéren zajlanak. Az első szakasz egy klinikai szakasz, ahol orvosaink megállapítják a betegek alkalmasságát és megfelelő tájékoztatás után megszerzik a beteg beleegyezést a mintavételezéshez. A kezelőorvos a beteget szóban tájékoztatja az Onkobank célkitűzéseiről, a mintavételről és a beteget megillető jogokról, ezt követően a beteg aláírásával igazolja, hogy elolvasta és ismeri a Betegtájékoztatóban foglaltakat. A Betegbeleegyező nyilatkozat aláírásával a beteg (vagy törvényes képviselője) és a tájékoztatást végző orvos igazolja a mintagyűjtéshez és tároláshoz való hozzájárulást. Ezen dokumentumok beteg általi megismerése és aláírása nélkül a Semmelweis Onkobank nem jogosult mintavételezésre, illetve a betegtől származó mintákhoz való hozzáféréshez. A alkalmasság megállapítása, a betegtájékoztatás és a betegbeleegyezés megszerzése összegezve a betegtoborzás folyamata. Kiskorú- vagy cselekvőképességében korlátolt személy esetében a tájékoztatást és a beleegyező nyilatkozat aláírását a szülő/törvényes képviselő felé szükséges irányozni. Amennyiben a beteg vagy törvényes képviselője olvasni nem tud, a beteg (vagy törvényes képviselőjének) aláírásától el lehet tekinteni, ilyenkor két független tanú írásos nyilatkozata is elégséges. Hasonlóképpen kell eljárni, ha a beteg - állapotából kifolyólag – nem tud aláírni és nincs jelen (vagy nem ismert) törvényes képviselője, de szóbeli beleegyezését adja a kutatásban való részvételhez.

 A beleegyező nyilatkozaton szerepelnie kell a tájékoztatást adó szakember nevének, beosztásának és aláírásának (orvosi pecsétjének), a beteg nevének, a beteg aláírásának és az aláírás dátumának is. A tájékoztatást és a beleegyezést külön íven kell írásba foglalni. A beleegyező nyilatkozat és az írásos tájékoztató egy-egy eredeti példányát a vizsgálati dokumentációban kell megőrizni, egy-egy eredeti példányát pedig a vizsgálati alanynak kell átadni. Ezen okból kifolyólag, a biológiai mintával együtt az aláírt Betegtájékoztató és Betegbeleegyező nyilatkozatoknak is meg kell érkezniük a Semmelweis Onkobankba. Ezt követően a beleegyező nyilatkozat szkennelt formátumát az adatbázisba (REDCap) fel kell tölteni és az eredeti nyilatkozatokat a biológiai mintáktól elkülönített helyiségben kell tárolni.

A jogszabályoknak megfelelően, a beteg a beleegyezését bármikor visszavonhatja, akár szóban, akár írásban indoklás és hátrányos következmények nélkül. Ehhez rendelkezésre áll a „Betegbeleegyező nyilatkozat visszavonása” c. dokumentum, amit a betegnek az orvosától kell igényelnie. Ez esetben az archivált gyűjteményben tárolt mintáit, valamint klinikai- és személyes adatait a Semmelweis Onkobank tudományos irányítója vagy eseti megbízottja 7 napon belül megsemmisíti.

 Kutatásaink alapvetően nem terjednek ki az öröklődő, csíravonalat érintő mutációk vizsgálatára. Mivel ezen adatok a beteg és elsőfokú rokonait érintő bizalmas és nagy körültekintést érintő információk, más jogszabályok vonatkoznak az öröklődő tumorok vizsgálatára (2008. évi XXI. törvény a humángenetikai adatok védelméről, a humángenetikai vizsgálatok és kutatások, valamint a biobankok működésének szabályairól). Amennyiben mégis csíravonalat érintő vizsgálatok elvégzése válik szükségessé, a törvényben leírtak szerint, a beteg utólagos beleegyezését kérjük az “Utólagos betegbeleegyező” nyilatkozat aláírásával, klinikai genetikussal történő konzultációt követően.

 

3.2. Mintagyűjtés

A minták az eredeti kezelések és beavatkozások keretein belül kerülnek vételezésre. Egyes esetekben a betegbeleegyezés megszerzését követően az orvosi vizsgálathoz fel nem használt és klinikai rutin megsemmisítésre ítélt vérminták kerülnek begyűjtésre a Semmelweis Onkobank részére vagy a beteg dönthet úgy, hogy vérvétel során számunkra is szolgáltat mintát.

A daganatokból származó minta, tartósítási módszertől függően, kétféle lehet: fagyasztva tartósított (krioprezervált) minta vagy formalin-fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) szövet.

A sebészeti műtét során eltávolított tumor csak a mintavétel elsődleges céljának teljesítése (diagnózis felállítása) mellett bocsátható a rendelkezésünkre. Amennyiben erre lehetőség van, a frissen kimetszett tumorból a műtét alatt/ után a megbízott patológus egy kb. borsónyi nagyságú szövetet az Onkobank számára elkülönít. Amennyiben az azonnali minta kimetszés és fagyasztás nem lehetséges, a hagyományos munkafolyamat után kerül hozzánk a minta: a műtét után a patológiai laboratórium dolgozza fel és konzerválja a mintát.

A feladatok ellátása közben észlelt bármilyen probléma esetén a Semmelweis Onkobank tudományos irányítóját kell értesíteni és az esetet rögzíteni kell az adatbázis megfelelő rovatában. Az esetek kimenetelének függvényében a tudományos irányító (esetleg a tudományos koordinátor) intézkedik a további teendőkről. A Semmelweis Onkobank hatás- és feladatkörét meghaladó problémák, hibák esetén az egyetemi minőségirányítási eljárás rendelkezéseit kell követni.

 

Betegségcsoportok, melyekben a biológiai minta gyűjtése történik:

Minden daganatos megbetegedésben szenvedő (beteg csoport) vagy ismerten daganatos megbetegedésben nem szenvedő egyén (kontroll csoport), aki a résztvevő intézetekben járó- vagy fekvőbeteg ellátásban részesül, és ő vagy törvényes képviselője megismeri a Betegtájékoztatóban foglaltakat, majd aláírja a Betegbeleegyező nyilatkozatot, amely kitér a mintavételre, mintatárolásra és a minta kutatási célból történő felhasználására is. A mintaszolgáltatás korra és nemre való tekintet nélkül megvalósulhat.

A résztvevő számára a kutatással összefüggő kár bekövetkezése, illetve személyiségi jog megsértése esetén nyújtandó kezelés, kártérítés és sérelemdíj esetén az Allianz Hungária Zrt. (1087 Bp. Könyves Kálmán Krt. 48-52.) a Semmelweis Egyetem felelősségbiztosítója.

 

3.3. Mintatárolás

 A mintákat a II. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika területén lévő Semmelweis Onkobank helyiségében, illetve Kutatólaboratóriumában tároljuk stabilitásuk, érzékenységük és a tárolási idő függvényében szobahőmérsékleten (pl. FFPE), 4°C-on (pl. frissen beérkezett vérminták), -20°C-on (pl. DNS), -80°C-on (pl. RNS) vagy -196°C-on (pl. krioprezervált szövetminta hosszútávú tárolása).

A mintatároló edényeken csak az adott beteghez/ mintához tartozó QR-kód és/ vagy vonalkód látható (kódolt mintatárolás). A laboratóriumi munkatárs vonalkódleolvasóval (szkenner) rögzíti és az adatbázisba vezeti fel a csövek helyzetét a mintatartó dobozban, valamint a tartódoboz pozícióját a tárolókanna állványain (rack) belül. Az adatbázisban ezáltal a beteghez tartozó minden minta és izolátum pontos helye összehangoltan lesz tárolva.

 

A tárolt mintatípusok:

        Krioprezervált tumor preparátumok (friss fagyasztásokból)

        Formalin-fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) szövetek

        Vérminták (natív csövekben, antikoaguláns, - vagy alvadást segítő vérvételi csövekben)

        Vér alakos elemek

        Vérplazma

        Szérum

        A kutatás során a feldolgozott mintákból származó DNS, RNS, fehérje.

Post mortem anyagoknál a minták intézeten belül használt kódját, a post mortem időt, az elhunyt személy nemét, korát, a mintavétel és tárolás időpontját, módját meg lehet adni. Az elhunyt személyazonosító adatait külső felhasználó nem kaphatja meg.

 

Biológiai minta gyűjtésének és tárolásának megvalósulási feltételei

• A biológiai minta gyűjtése és tárolása teljes egészében a Helsinki Deklaráció alapelveinek megfelelően és annak szellemében történik.

• A beteg vagy hozzátartozójának megfelelő tájékoztatása a kezelőorvos által az egyéb rutin diagnosztikus eljárásokhoz hasonlóan történik szóban és írásban.

• A részletes tájékoztatás után a beteg vagy törvényes képviselője a Betegbeleegyező és Betegtájékoztató nyilatkozat aláírásával tanúsítja részvételi szándékát, amelyet bármikor, hátrányos következmények nélkül visszavonhat . Csíravonalat érintő vizsgálatok esetén klinikai genetikussal történő konzultációt követően az Utólagos betegbeleegyező nyilatkozat aláírása szükséges.

• A mintából származó információ nem közölhető a beteg után érdeklődő hozzátartozóval, baráttal, kizárólag az adott egyénnel vagy azokkal a személyekkel, akiket az egyén írásban megjelöl a Betegbeleegyező nyilatkozatában). Elhunyt egyén esetén az elhunyt hozzátartozója kaphat információt.

• Kutatási célból külföldre minta csak olyan országba szállítható, amely országnak legalább Magyarországon hatályos vagy annál szigorúbb adatvédelmi szabályozása áll fenn. A minták külföldre történő szállítása engedélyköteles, elfogadott kutatási terv mellett.

 

3.4. Adatrögzítés

A mintagyűjtést irányító orvos a beteg kórlapja,- valamint a MEDSOL rendszer alapján, a Semmelweis Onkobank kutatómunkájához kapcsolódó személyi és egészségügyi adatokat a Semmelweis Onkobank rendelkezésére bocsátja a mintavételt megelőző, és az azt követő időszakból (utánkövetés). A begyűjtött személyi- és egészségügyi adatokat, a minták adatait, valamint a kutatólaboratóriumban zajló vizsgálatokból származó adatokat a Semmelweis Onkobank arra megbízott munkatársai egy biztonságos, online elérhető adatbázisban rögzítik. A HIPAA,- GDPR,- FISMA,- és 21 CFR Part-11 megfelelésekkel rendelkező, National Institute of Health (NIH) által támogatott és kifejezetten hosszútávú, biztonságos, klinikai adatgyűjtésre fejlesztett REDCap (Research Electronic Data Capture) adatbázist használjuk. Az Onkobankban minden beteg egyedi azonosítót kap. A számozás AA001-től kezdődik. A REDCap-ből történő exportálás személyazonosító adatok nélkül is megvalósítható, így a későbbiekben a beteg azonosítása ezzel a kóddal történik.

A betegtájékoztatóban foglaltak szerint a továbbiakban a mintaadók személyi és egészségügyi adatait a hatályos adatvédelmi jogszabályok (1997. évi XLVII. törvény) betartása mellett kezeljük és használjuk fel kutatási célokra.

A Semmelweis Onkobank kutatási célból a következő egészségügyi (klinikai) adatokat gyűjti:

-       nem, életkor

-       epidemiológiai adatok (dohányzás, vírusfertőzés…)

-       a vételezett minta vagy minták jellege (vér- vagy daganatból származó szövetminta)

-       diagnózisok dátummal (betegség megnevezése vagy kontroll)

-       patológiai diagnosztika, amennyiben releváns (szöveti eredet, szövettan, stage, grade, TNM)

-       laboratóriumi és radiológiai diagnosztikai tesztek eredményei

-       a kezelt daganatos megbetegedés ismert molekuláris illetve sejtbiológiai jellemzői

-       sebészeti, radiológiai és gyógyszeres kezelések

-       utánkövetés (kontrollok ideje)

-       relapszusmentes és teljes túlélés hossza

íMinőségbiztosítási célból az adatok integritását a laboratórium orvosa ellenőrzi a mintavevő orvostól függetlenül a MEDSOL adatok és az adatbázis összehasonlításával.

Az adatbázist csak az arra jogosult személyek használhatják. Az adatbázis-felelős (admin) felhasználói jogosultságokat beállítva tudja szabályozni, hogy melyik munkatárs milyen adatokat, funkciókat érhet el a REDCap felületén, biztosítva az adatok konzisztenciáját és biztonságát. Az adatbázis szoftveres fejlesztését is a Semmelweis Onkobank adatbázis-felelős munkatársa végzi.

 

3.5. A tárolt biológiai minták felhasználása

A kutatólaboratóriumban dolgozó munkatársak a minták feldolgozását és adatbázisban rögzítését követően megkezdik a kutatómunka megszervezését, elvégzését a tumor típusától, az irodalmi adatok és az alkalmazni kívánt vizsgálat függvényében. A kutatáshoz az alábbi eljárásokat használhatjuk:

     Irodalomkutatás

     DNS-szekvenálás (teljes exom szekvenálás (WES), célzott szekvenálás)

     RNS-szekvenálás

     qPCR

     Tömegspektrometria (MS/MS)

     Adatfeldolgozás, kiértékelés - többek között - Galaxy platform (Afgan és mtsai., Nucleic Acids Research, 2018. doi:10.1093/nar/gky379) vagy RStudio (RStudio Team (2020). RStudio: Integrated Development for R. RStudio, PBC, Boston, MA URL) alkalmazásával.

Céljaink között szerepel:

     A betegség patogenezisére vonatkozó, genomikai, transzkriptomikai és proteomikai alapkutatások

     Diagnosztikus, prediktív és prognosztikus biomarkerek identifikációja

     Túlélésre vonatkozó vizsgálatok

A Semmelweis Onkobank kutatólaboratóriumába beérkező vér- illetve tumorminták feldolgozásának része, hogy DNS-t és RNS-t, valamint fehérjét izolálunk belőlük. Az izolálást a reagensek gyártóinak ajánlása szerint végezzük el. Az izolátumok a kutatólaboratórium fagyasztóiban, ultramélyhűtőjében, illetve folyékony nitrogén tárolójában kerülnek tárolásra. A kutatómunka során a daganatképződéssel összefüggésbe hozható mutációkat (DNS) keresünk, valamint gén- és fehérjeexpressziós adatokat nyerünk ki (RNS- és fehérjeminták) genomikai, transzkriptomikai és proteomikai eljárások által.

A Semmelweis Onkobankban tárolt minták és a hozzájuk tartozó adatok felhasználása tudományos kutatás céljából belső (klinikai), vagy külső kutatócsoportnak kizárólag a Semmelweis Onkobank vezetőjének engedélyével, engedélyezett kutatási projekt keretében lehetséges. A minták Onkobankból történő kivitelére kizárólag a Semmelweis Onkobank tudományos irányítója jogosult, a minták átadása/átvétele írásos dokumentációban rögzítendő.

 

  1. Publikációs elvek:

Munkánk egyik fő céljának a tudomány előmenetelének támogatását tekintjük, melynek egyik legfontosabb momentuma a résztvevők publikációs tevékenységének elősegítése és a Semmelweis Egyetem hírnevének öregbítése. A kutatómunka eredményeinek ismertetése szóbeli (előadás) és írásbeli (poszter, tudományos cikk, stb) publikációk formájában lehetséges.

A kutatás megalapozottságát alátámasztó, válogatott közlemények (a résztvevők teljes publikációs tevékenysége elérhető az MTMT adatbázisban):

1: Nagy, Á., Lánczky, A., Menyhárt, O., & Győrffy, B. (2018). Validation of miRNA prognostic power in hepatocellular carcinoma using expression data of independent datasets. Scientific reports, 8(1), 1-9.

2: Győrffy, B., Surowiak, P., Budczies, J., & Lánczky, A. (2013). Online survival analysis software to assess the prognostic value of biomarkers using transcriptomic data in non-small-cell lung cancer. PloS one, 8(12), e82241.

3: Lánczky, A., Nagy, Á., Bottai, G., Munkácsy, G., Szabó, A., Santarpia, L., & Győrffy, B. (2016). miRpower: a web-tool to validate survival-associated miRNAs utilizing expression data from 2178 breast cancer patients. Breast cancer research and treatment, 160(3), 439-446.

4: Nagy, Á., Munkácsy, G., & Győrffy, B. (2021). Pancancer survival analysis of cancer hallmark genes. Scientific reports, 11(1), 1-10.

5: Bartha, Á., & Győrffy, B. (2019). Comprehensive outline of whole exome sequencing data analysis tools available in clinical oncology. Cancers, 11(11), 1725.

6: Bartha, Á., & Győrffy, B. (2021). TNMplot. com: a web tool for the comparison of gene expression in normal, tumor and metastatic tissues. International Journal of Molecular Sciences, 22(5), 2622.

7: Munkácsy, G., Abdul-Ghani, R., Mihály, Z., Tegze, B., Tchernitsa, O., Surowiak, P., ... & Györffy, B. (2010). PSMB7 is associated with anthracycline resistance and is a prognostic biomarker in breast cancer. British journal of cancer, 102(2), 361-368.

8: Menyhárt, O., Nagy, Á., & Győrffy, B. (2018). Determining consistent prognostic biomarkers of overall survival and vascular invasion in hepatocellular carcinoma. Royal Society open science, 5(12), 181006.

9: Győrffy, B., Benke, Z., Lánczky, A., Balázs, B., Szállási, Z., Timár, J., & Schäfer, R. (2012). RecurrenceOnline: an online analysis tool to determine breast cancer recurrence and hormone receptor status using microarray data. Breast cancer research and treatment, 132(3), 1025-1034.

10: Győrffy, B., Bottai, G., Fleischer, T., Munkácsy, G., Budczies, J., Paladini, L., ... & Santarpia, L. (2016). Aberrant DNA methylation impacts gene expression and prognosis in breast cancer subtypes. International journal of cancer, 138(1), 87-97.