RÉSZLETES KUTATÁSI TERV
„Diagnosztikus, prediktív és prognosztikus biomarkerek azonosítása rosszindulatú daganatos megbetegedésekben” című kutatáshoz
1. A vizsgálat célja:
Célul tűztük ki a Semmelweis Egyetem (SE) klinikáinak ambulanciáin és fekvőbeteg osztályain kezelt, rosszindulatú daganatos megbetegedésekben szenvedő betegek biológiai mintáinak (tumor és normál szövet, vér) gyűjtését és tárolását, valamint klinikai adatainak hosszútávú gyűjtését, amellyel a kórlefolyásról és túlélésről kaphatunk információt. Szöveti mintavétel minden esetben csak a daganat eltávolításának céljából történik, a Semmelweis Onkobank ezeket a mintákat formalin-fixált, paraffinba-ágyazott (FFPE) formában vagy krioprezervált preparátumként kapja meg. A vérminták beküldése történhet natív, anti-koagulánst vagy pro-koagulánst tartalmazó vérvételi csövekben is, amelyekből plazma, szérum vagy buffy-coat kerül elkülönítésre. Az Onkobankba érkezett mintákból DNS, RNS és fehérje kerül izolálásra, amelyeket genomikai, transzkriptomikai és proteomikai vizsgálatokhoz használunk fel. Az így kapott adatok elemzése által a daganatképződéssel együttjáró mutációs,- génexpressziós,- és fehérjeexpressziós profilokat állíthatunk fel, amelyekkel diagnosztikus, prediktív és prognosztikus biomarkereket azonosíthatunk be. A biomarkerek, illetve a túlélési adatok ismeretében lehetőségünk nyílik olyan egyéni, “omikai” kombinációk feltárására, amelyek a betegek korai, pontosabb diagnózisát, betegségük lefolyását, illetve a terápiás válaszukat befolyásolhatják.
A Bioinformatika Tanszék végső célja tehát egy olyan újgenerációs onkológiai egység, a Semmelweis Onkobank (Semmelweis Onkológiai Szövetbank), létrehozása és működtetése, amely Európában egyedülállóan dolgoz fel és tárol rosszindulatú daganatos megbetegedésekben szenvedő egyének vér, illetve szövetmintáit és az azokhoz tartozó klinikai-, genomikai, transzkriptomikai- és proteomikai adatokat. A minták tárolása - stabilitásuk, érzékenységük és a tárolási idejük függvényében - történhet szobahőmérsékleten, 4°C-on, -20°C-on, -80°C-on vagy -196°C-on.
2. A vizsgálat elrendezése:
A mintegy 25 évre tervezett kutatási időszakot (2021. 05. 01.-től kezdődően) a betegek túlélésének monitorozására használjuk (utánkövetés) a gyűjtött adatok függvényében. A betegtoborzás korra és nemre való tekintet nélkül megvalósulhat. A kutatásba való bevonás elengedhetetlen feltétele a beteg tájékozott hozzájárulása a vizsgálatokhoz a “Betegtájékoztató” és a “Betegbeleegyező nyilatkozat” aláírásával. A nyilatkozat bármikor, hátrányos következmények nélkül visszavonható a “Betegbeleegyező nyilatkozat visszavonása” c. dokumentum aláírásával. A kritériumrendszerek részletes leírása a “Kutatási engedélykérelem” c. dokumentumban olvasható.
A fenti feladathoz a megfelelő infrastruktúrát és a személyi feltételeket a Semmelweis Onkobank biztosítja, a betegek biológiai mintáit pedig az intézet megbízott orvosai, szakasszisztensei szolgáltatják részünkre. Munkatársaink, szakembereink szakmájukra hivatásként tekintenek, munkájukat pedig ennek szellemében, a lehető legkörültekintőbben végzik el. Az Semmelweis Onkobank vezetése biztosítja, hogy munkatársai a minőségirányítási rendszeréhez tartozó dokumentumokat megismerjék, munkájuk során alkalmazzák és a fenti tevékenységeket az MSZ EN ISO 9001:2015 szabványoknak megfelelően végezzék el.
A Semmelweis Onkobank résztvevő tagintézményei:
- II. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika
- Asklepios Kliniken Hamburg GmbH
- Belgyógyászati és Onkológiai Klinika
- Bőr-, Nemikórtani és Bőronkológiai Klinika
- Energiatudományi Kutatóközpont
- Flór Ferenc Kórház
- Laboratóriumi Medicina Intézet
- Országos Mentális, Ideggyógyászati és Idegsebészeti Intézet
- Orvosi Képalkotó Klinika
- Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet
- Patológiai, Igazságügyi és Biztosítási Orvostani Intézet
- Pulmonológiai Klinika
- Sebészeti, Transzplantációs és Gasztroenterológiai Klinika
- Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika
- Urológiai Klinika
- Új Szent János Kórház és Szakrendelő.
A Semmelweis Onkobank megvalósításában közreműködő munkatársak:
- a Semmelweis Onkobank tudományos irányítója,
- a Semmelweis Onkobank koordinátora,
- a mintavételt végző orvosok,
- a diagnosztikai véleményt alkotó patológusok,
- a szövettani feldolgozást végző asszisztensek,
- a vérvételben és adatrögzítésben szerepet játszó nővérek és asszisztensek,
- a laboratóriumi orvos,
- a laboratóriumi munkatársak (mintagyűjtés, - feldolgozás…),
- a Semmelweis Onkobank adatbázisának felelőse,
- illetve egyetemi hallgatók,
akik feladatukat állandó- vagy megbízási szerződések alapján végzik.
3. A vizsgálat módszertana, megszervezése:
3.1. Tájékoztatás
Vizsgálataink alapvetően két színtéren zajlanak. Az első szakasz egy klinikai szakasz, ahol orvosaink megállapítják a betegek alkalmasságát és megfelelő tájékoztatás után megszerzik a beteg beleegyezést a mintavételezéshez. A kezelőorvos a beteget szóban tájékoztatja az Onkobank célkitűzéseiről, a mintavételről és a beteget megillető jogokról, ezt követően a beteg aláírásával igazolja, hogy elolvasta és ismeri a Betegtájékoztatóban foglaltakat. A Betegbeleegyező nyilatkozat aláírásával a beteg (vagy törvényes képviselője) és a tájékoztatást végző orvos igazolja a mintagyűjtéshez és tároláshoz való hozzájárulást. Ezen dokumentumok beteg általi megismerése és aláírása nélkül a Semmelweis Onkobank nem jogosult mintavételezésre, illetve a betegtől származó mintákhoz való hozzáféréshez. A alkalmasság megállapítása, a betegtájékoztatás és a betegbeleegyezés megszerzése összegezve a betegtoborzás folyamata. Kiskorú- vagy cselekvőképességében korlátolt személy esetében a tájékoztatást és a beleegyező nyilatkozat aláírását a szülő/törvényes képviselő felé szükséges irányozni. Amennyiben a beteg vagy törvényes képviselője olvasni nem tud, a beteg (vagy törvényes képviselőjének) aláírásától el lehet tekinteni, ilyenkor két független tanú írásos nyilatkozata is elégséges. Hasonlóképpen kell eljárni, ha a beteg - állapotából kifolyólag – nem tud aláírni és nincs jelen (vagy nem ismert) törvényes képviselője, de szóbeli beleegyezését adja a kutatásban való részvételhez.
A beleegyező nyilatkozaton szerepelnie kell a tájékoztatást adó szakember nevének, beosztásának és aláírásának (orvosi pecsétjének), a beteg nevének, a beteg aláírásának és az aláírás dátumának is. A tájékoztatást és a beleegyezést külön íven kell írásba foglalni. A beleegyező nyilatkozat és az írásos tájékoztató egy-egy eredeti példányát a vizsgálati dokumentációban kell megőrizni, egy-egy eredeti példányát pedig a vizsgálati alanynak kell átadni. Ezen okból kifolyólag, a biológiai mintával együtt az aláírt Betegtájékoztató és Betegbeleegyező nyilatkozatoknak is meg kell érkezniük a Semmelweis Onkobankba. Ezt követően a beleegyező nyilatkozat szkennelt formátumát az adatbázisba (REDCap) fel kell tölteni és az eredeti nyilatkozatokat a biológiai mintáktól elkülönített helyiségben kell tárolni.
A jogszabályoknak megfelelően, a beteg a beleegyezését bármikor visszavonhatja, akár szóban, akár írásban indoklás és hátrányos következmények nélkül. Ehhez rendelkezésre áll a „Betegbeleegyező nyilatkozat visszavonása” c. dokumentum, amit a betegnek az orvosától kell igényelnie. Ez esetben az archivált gyűjteményben tárolt mintáit, valamint klinikai- és személyes adatait a Semmelweis Onkobank tudományos irányítója vagy eseti megbízottja 7 napon belül megsemmisíti.
Kutatásaink alapvetően nem terjednek ki az öröklődő, csíravonalat érintő mutációk vizsgálatára. Mivel ezen adatok a beteg és elsőfokú rokonait érintő bizalmas és nagy körültekintést érintő információk, más jogszabályok vonatkoznak az öröklődő tumorok vizsgálatára (2008. évi XXI. törvény a humángenetikai adatok védelméről, a humángenetikai vizsgálatok és kutatások, valamint a biobankok működésének szabályairól). Amennyiben mégis csíravonalat érintő vizsgálatok elvégzése válik szükségessé, a törvényben leírtak szerint, a beteg utólagos beleegyezését kérjük az “Utólagos betegbeleegyező” nyilatkozat aláírásával, klinikai genetikussal történő konzultációt követően.
3.2. Mintagyűjtés
A minták az eredeti kezelések és beavatkozások keretein belül kerülnek vételezésre. Egyes esetekben a betegbeleegyezés megszerzését követően az orvosi vizsgálathoz fel nem használt és klinikai rutin megsemmisítésre ítélt vérminták kerülnek begyűjtésre a Semmelweis Onkobank részére vagy a beteg dönthet úgy, hogy vérvétel során számunkra is szolgáltat mintát.
A daganatokból származó minta, tartósítási módszertől függően, kétféle lehet: fagyasztva tartósított (krioprezervált) minta vagy formalin-fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) szövet.
A sebészeti műtét során eltávolított tumor csak a mintavétel elsődleges céljának teljesítése (diagnózis felállítása) mellett bocsátható a rendelkezésünkre. Amennyiben erre lehetőség van, a frissen kimetszett tumorból a műtét alatt/ után a megbízott patológus egy kb. borsónyi nagyságú szövetet az Onkobank számára elkülönít. Amennyiben az azonnali mintakimetszés és fagyasztás nem lehetséges, a hagyományos munkafolyamat után kerül hozzánk a minta: a műtét után a patológiai laboratórium dolgozza fel és konzerválja a mintát.
A feladatok ellátása közben észlelt bármilyen probléma esetén a Semmelweis Onkobank tudományos irányítóját kell értesíteni és az esetet rögzíteni kell az adatbázis megfelelő rovatában. Az esetek kimenetelének függvényében a tudományos irányító (esetleg a tudományos koordinátor) intézkedik a további teendőkről. A Semmelweis Onkobank hatás- és feladatkörét meghaladó problémák, hibák esetén az egyetemi minőségirányítási eljárás rendelkezéseit kell követni.
Betegségcsoportok, melyekben a biológiai minta gyűjtése történik:
Minden daganatos megbetegedésben szenvedő (beteg csoport) vagy ismerten daganatos megbetegedésben nem szenvedő egyén (kontroll csoport), aki a résztvevő intézetekben járó- vagy fekvőbeteg ellátásban részesül, és ő vagy törvényes képviselője megismeri a Betegtájékoztatóban foglaltakat, majd aláírja a Betegbeleegyező nyilatkozatot, amely kitér a mintavételre, mintatárolásra és a minta kutatási célból történő felhasználására is. A mintaszolgáltatás korra és nemre való tekintet nélkül megvalósulhat.
A résztvevő számára a kutatással összefüggő kár bekövetkezése, illetve személyiségi jog megsértése esetén nyújtandó kezelés, kártérítés és sérelemdíj esetén az Allianz Hungária Zrt. (1087 Bp. Könyves Kálmán Krt. 48-52.) a Semmelweis Egyetem felelősségbiztosítója.
3.3. Mintatárolás
A mintákat a II. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika területén lévő Semmelweis Onkobank helyiségében, illetve Kutatólaboratóriumában tároljuk stabilitásuk, érzékenységük és a tárolási idő függvényében szobahőmérsékleten (pl. FFPE), 4°C-on (pl. frissen beérkezett vérminták), -20°C-on (pl. DNS), -80°C-on (pl. RNS) vagy -196°C-on (pl. krioprezervált szövetminta hosszútávú tárolása).
A mintatároló edényeken csak az adott beteghez/ mintához tartozó QR-kód és/ vagy vonalkód látható (kódolt mintatárolás). A laboratóriumi munkatárs vonalkódleolvasóval (szkenner) rögzíti és az adatbázisba vezeti fel a csövek helyzetét a mintatartó dobozban, valamint a tartódoboz pozícióját a tárolókanna állványain (rack) belül. Az adatbázisban ezáltal a beteghez tartozó minden minta és izolátum pontos helye összehangoltan lesz tárolva.
A tárolt mintatípusok:
- Krioprezervált tumor preparátumok (friss fagyasztásokból)
- Formalin-fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) szövetek
- Vérminták (natív csövekben, antikoaguláns, - vagy alvadást segítő vérvételi csövekben)
- Vér alakos elemek
- Vérplazma
- Szérum
- A kutatás során a feldolgozott mintákból származó DNS, RNS, fehérje.
Post mortem anyagoknál a minták intézeten belül használt kódját, a post mortem időt, az elhunyt személy nemét, korát, a mintavétel és tárolás időpontját, módját meg lehet adni. Az elhunyt személyazonosító adatait külső felhasználó nem kaphatja meg.
Biológiai minta gyűjtésének és tárolásának megvalósulási feltételei
• A biológiai minta gyűjtése és tárolása teljes egészében a Helsinki Deklaráció alapelveinek megfelelően és annak szellemében történik.
• A beteg vagy hozzátartozójának megfelelő tájékoztatása a kezelőorvos által az egyéb rutin diagnosztikus eljárásokhoz hasonlóan történik szóban és írásban.
• A részletes tájékoztatás után a beteg vagy törvényes képviselője a Betegbeleegyező és Betegtájékoztató nyilatkozat aláírásával tanúsítja részvételi szándékát, amelyet bármikor, hátrányos következmények nélkül visszavonhat . Csíravonalat érintő vizsgálatok esetén klinikai genetikussal történő konzultációt követően az Utólagos betegbeleegyező nyilatkozat aláírása szükséges.
• A mintából származó információ nem közölhető a beteg után érdeklődő hozzátartozóval, baráttal, kizárólag az adott egyénnel vagy azokkal a személyekkel, akiket az egyén írásban megjelöl a Betegbeleegyező nyilatkozatában). Elhunyt egyén esetén az elhunyt hozzátartozója kaphat információt.
• Kutatási célból külföldre minta csak olyan országba szállítható, amely országnak legalább Magyarországon hatályos vagy annál szigorúbb adatvédelmi szabályozása áll fenn. A minták külföldre történő szállítása engedélyköteles, elfogadott kutatási terv mellett.
3.4. Adatrögzítés
A mintagyűjtést irányító orvos a beteg kórlapja,- valamint a MEDSOL rendszer alapján, a Semmelweis Onkobank kutatómunkájához kapcsolódó személyi és egészségügyi adatokat a Semmelweis Onkobank rendelkezésére bocsátja a mintavételt megelőző, és az azt követő időszakból (utánkövetés). A begyűjtött személyi- és egészségügyi adatokat, a minták adatait, valamint a kutatólaboratóriumban zajló vizsgálatokból származó adatokat a Semmelweis Onkobank arra megbízott munkatársai egy biztonságos, online elérhető adatbázisban rögzítik. A HIPAA,- GDPR,- FISMA,- és 21 CFR Part-11 megfelelésekkel rendelkező, National Institute of Health (NIH) által támogatott és kifejezetten hosszútávú, biztonságos, klinikai adatgyűjtésre fejlesztett REDCap (Research Electronic Data Capture) adatbázist használjuk. Az Onkobankban minden beteg egyedi azonosítót kap. A számozás AA001-től kezdődik. A REDCap-ből történő exportálás személyazonosító adatok nélkül megvalósítható, így a későbbiekben a beteg azonosítása ezzel a kóddal történik.
A betegtájékoztatóban foglaltak szerint a továbbiakban a mintaadók személyi és egészségügyi adatait a hatályos adatvédelmi jogszabályok (1997. évi XLVII. törvény) betartása mellett kezeljük és használjuk fel kutatási célokra.
A Semmelweis Onkobank kutatási célból a következő egészségügyi (klinikai) adatokat gyűjti:
- nem, életkor
- epidemiológiai adatok (dohányzás, vírusfertőzés…)
- a vételezett minta vagy minták jellege (vér- vagy daganatból származó szövetminta)
- diagnózisok dátummal (betegség megnevezése vagy kontroll)
- patológiai diagnosztika, amennyiben releváns (szöveti eredet, szövettan, stage, grade, TNM)
- laboratóriumi és radiológiai diagnosztikai tesztek eredményei
- a kezelt daganatos megbetegedés ismert molekuláris illetve sejtbiológiai jellemzői
- sebészeti, radiológiai és gyógyszeres kezelések
- utánkövetés (kontrollok ideje)
- relapszusmentes és teljes túlélés hossza
Minőségbiztosítási célból az adatok integritását a laboratórium orvosa ellenőrzi a mintavevő orvostól függetlenül a MEDSOL adatok és az adatbázis összehasonlításával.
Az adatbázist csak az arra jogosult személyek használhatják. Az adatbázis-felelős (admin) felhasználói jogosultságokat beállítva tudja szabályozni, hogy melyik munkatárs milyen adatokat, funkciókat érhet el a REDCap felületén, biztosítva az adatok konzisztenciáját és biztonságát. Az adatbázis szoftveres fejlesztését is a Semmelweis Onkobank adatbázis-felelős munkatársa végzi.
3.5. A tárolt biológiai minták felhasználása
A kutatólaboratóriumban dolgozó munkatársak a minták feldolgozását és adatbázisban rögzítését követően megkezdik a kutatómunka megszervezését, elvégzését a tumor típusától, az irodalmi adatok és az alkalmazni kívánt vizsgálat függvényében. A kutatáshoz az alábbi eljárásokat használhatjuk:
- Irodalomkutatás
- DNS-szekvenálás (teljes exom szekvenálás (WES), célzott szekvenálás)
- RNS-szekvenálás
- qPCR
- Tömegspektrometria (MS/MS)
- Adatfeldolgozás, kiértékelés - többek között - Galaxy platform (Afgan és mtsai., Nucleic Acids Research, 2018. doi:10.1093/nar/gky379) vagy RStudio (RStudio Team (2020). RStudio: Integrated Development for R. RStudio, PBC, Boston, MA URL) alkalmazásával.
Céljaink között szerepel:
- A betegség patogenezisére vonatkozó, genomikai, transzkriptomikai és proteomikai alapkutatások
- Diagnosztikus, prediktív és prognosztikus biomarkerek identifikációja
- Túlélésre vonatkozó vizsgálatok
A Semmelweis Onkobank kutatólaboratóriumába beérkező vér- illetve tumorminták feldolgozásának része, hogy DNS-t és RNS-t, valamint fehérjét izolálunk belőlük. Az izolálást a reagensek gyártóinak ajánlása szerint végezzük el. Az izolátumok a kutatólaboratórium fagyasztóiban, ultramélyhűtőjében, illetve folyékony nitrogén tárolójában kerülnek tárolásra. A kutatómunka során a daganatképződéssel összefüggésbe hozható mutációkat (DNS) keresünk, valamint gén- és fehérjeexpressziós adatokat nyerünk ki (RNS- és fehérjeminták) genomikai, transzkriptomikai és proteomikai eljárások által.
A Semmelweis Onkobankban tárolt minták és a hozzájuk tartozó adatok felhasználása tudományos kutatás céljából belső (klinikai), vagy külső kutatócsoportnak kizárólag a Semmelweis Onkobank vezetőjének engedélyével, engedélyezett kutatási projekt keretében lehetséges. A minták Onkobankból történő kivitelére kizárólag a Semmelweis Onkobank tudományos irányítója jogosult, a minták átadása/átvétele írásos dokumentációban rögzítendő.
4. Publikációs elvek:
Munkánk egyik fő céljának a tudomány előmenetelének támogatását tekintjük, melynek egyik legfontosabb momentuma a résztvevők publikációs tevékenységének elősegítése és a Semmelweis Egyetem hírnevének öregbítése. A kutatómunka eredményeinek ismertetése szóbeli (előadás) és írásbeli (poszter, tudományos cikk, stb) publikációk formájában lehetséges.
A kutatás megalapozottságát alátámasztó, válogatott közlemények (a résztvevők teljes publikációs tevékenysége elérhető az MTMT adatbázisban):
1: Nagy, Á., Lánczky, A., Menyhárt, O., & Győrffy, B. (2018). Validation of miRNA prognostic power in hepatocellular carcinoma using expression data of independent datasets. Scientific reports, 8(1), 1-9.
2: Győrffy, B., Surowiak, P., Budczies, J., & Lánczky, A. (2013). Online survival analysis software to assess the prognostic value of biomarkers using transcriptomic data in non-small-cell lung cancer. PloS one, 8(12), e82241.
3: Lánczky, A., Nagy, Á., Bottai, G., Munkácsy, G., Szabó, A., Santarpia, L., & Győrffy, B. (2016). miRpower: a web-tool to validate survival-associated miRNAs utilizing expression data from 2178 breast cancer patients. Breast cancer research and treatment, 160(3), 439-446.
4: Nagy, Á., Munkácsy, G., & Győrffy, B. (2021). Pancancer survival analysis of cancer hallmark genes. Scientific reports, 11(1), 1-10.
5: Bartha, Á., & Győrffy, B. (2019). Comprehensive outline of whole exome sequencing data analysis tools available in clinical oncology. Cancers, 11(11), 1725.
6: Bartha, Á., & Győrffy, B. (2021). TNMplot. com: a web tool for the comparison of gene expression in normal, tumor and metastatic tissues. International Journal of Molecular Sciences, 22(5), 2622.
7: Munkácsy, G., Abdul-Ghani, R., Mihály, Z., Tegze, B., Tchernitsa, O., Surowiak, P., ... & Györffy, B. (2010). PSMB7 is associated with anthracycline resistance and is a prognostic biomarker in breast cancer. British journal of cancer, 102(2), 361-368.
8: Menyhárt, O., Nagy, Á., & Győrffy, B. (2018). Determining consistent prognostic biomarkers of overall survival and vascular invasion in hepatocellular carcinoma. Royal Society open science, 5(12), 181006.
9: Győrffy, B., Benke, Z., Lánczky, A., Balázs, B., Szállási, Z., Timár, J., & Schäfer, R. (2012). RecurrenceOnline: an online analysis tool to determine breast cancer recurrence and hormone receptor status using microarray data. Breast cancer research and treatment, 132(3), 1025-1034.
10: Győrffy, B., Bottai, G., Fleischer, T., Munkácsy, G., Budczies, J., Paladini, L., ... & Santarpia, L. (2016). Aberrant DNA methylation impacts gene expression and prognosis in breast cancer subtypes. International journal of cancer, 138(1), 87-97.